Pengecatan Gram

Zat warna terdiri dari zat warna basa seperti methylene blue (methylene chloride), serta zat warna asam yang mempunyai chromophore anionik contohnya eosin. Chromophore anionik, eosinate, tidak dapat dipakai untuk mengecat bakteri. Waktu pengecatan antara 30 detik-2 menit tergantung afinitas zat warnanya.

Cat Gram yang digunakan terdiri dari 4 macam, yaitu :

Larutan/cat gram A (Carbol Gentian Violet), sebagai cat utama 

Larutan/cat gram B (Lugol), untuk mengintensifkan warna 

Larutan/cat gram C (Alkohol 96%), peluntur/pencucian 

Larutan/cat gram D (Fuchsin),cat penutup/cat lawan 

Masing-masing zat warna memberikan warna yang berbeda-beda. Fuchsin memberikan warna merah keungu-unguan, Safranin memberikan warna merah, Carbol Gentian Violet memberikan warna ungu, methylene blue memberikan warna biru dan safranin memberikan warna merah. 

Komposisi dan fungsi masing-masing cat Gram, adalah sebagai berikut : 

1. Cat Gram A 

Cat ini terdiri atas : 

Kristal violet : 2 gram 

Etil alkohol 95 : 20 ml 

Ammonium oksalat : 0,8 gram 

Akuades : 80 ml 

Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet). Cat Gram A merupakan cat primer yang akan memberi warna mikroorganisme target. Pada saat diberi cat ini, semua mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A. 

2. Cat Gram B 

Cat ini terdiri atas : 

Yodium : 1 gram 

Kalium Yodida : 2 gram 

Akuades : 300 ml 

Cat Gram B berwarna coklat. Cat Gram B merupakan cat Mordan, yaitu cat atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme target. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat). 

3. Cat Gram C 

Cat ini terdiri atas : 

Aseton : 50 ml 

Etil alkohol 95 % : 50 ml 

Cat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya. Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan : 

Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian disebut bakteri Gram positif. 

Bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif. 

4. Cat Gram D 

Cat Gram D terdiri atas : 

Safranin : 0,25 gram 

Etil alkohol 95 % : 10 ml 

Akuades : 90 ml 

Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Akibat pemberian cat Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan : 

Bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu, karena telah jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu lagi mengikat cat Gram D. 

Bakteri Gram negatif akan berwarna merah, karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu mengikat cat Gram D. 

Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. 

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50nm) sedangkan pada bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).