Showing posts with label Pewarnaan. Show all posts
Showing posts with label Pewarnaan. Show all posts
Metode ini ditemukan oleh dua ilmuwan asal Jerman, Dr. Franz Ziehl (1857-1926) ahli bakteriologi dan Friedrich Carl Adolf Neelsen (1854-1898) seorang ahli patologi.

Salah satu bahan yang digunakan untuk mendiagnosa adalah dahak atau sputum. Dahak yang diperiksa paling sedikit 3-5 cc. Jika jumlah kuman kurang dari 5000 dalam 1 cc dahak, maka itu tidak akan kelihatan di bawah mikroskop.

Dahak yang diambil ialah dahak yang kental kuning kehijauan sebanyak 3-5 cc, dengan waktu pengambilan sebagai berikut :
  • Dahak sewaktu, penderita datang berobat dengan keluhan apa saja ke poliklinik.
  • Dahak pagi, yang diambil besok paginya begitu bangun tidur.
  • Dahak sewaktu, yang diambil sewaktu penderita mengantar dahak pagi tersebut.
Ludah tidak dapat diperiksa karena ludah berasal dari kelenjar dalam rongga mulut. Biasanya dalam ludah tidak terdapat kuman TB.

Bakteri tahan asam adalah bakteri yang mempertahankan zat warna karbol-fuchsin (fuchsin basa yang dilarutkan dalam suatu campuran phenol-alkohol-air) meskipun dicuci dengan asam klorida dalam alkohol. Sediaan bakter ini disiram dengan cairan karbol fuchsin kemudian dipanaskan sampai keluar uap. Setelah itu, zat warna dicuci dengan asam alkohol dan akhirnya diberi warna kontras (biru atau hijau). Bakteri-bakteri tahan asam (spesies Mycobakterium dan beberapa Actinomycetes yang serumpun) berwarna merah dan yang lain-lain akan berwarna sesuai warna kontras.

Mycrobakteria adalah bakteri aerob berbentuk batang, yang tidak membentuk spora. Walaupun tidak mudah diwarnai bakteri ini tahan terhadap penghilangan warna (dekolorisasi) oleh asam atau alkohol dan karena itu dinamakan basil tahan asam. Ciri –ciri khas Mycobakterium tuberculosis dalam jaringan, basil tuberkel merupakan batang ramping lurus berukuran kira-kira 0,4 x 3 µm. Pada perbenihan buatan terlihat bentuk coccus dan filamen. Mycobakteria tidak dapat diklasifikasikan sebagai gram positif atau gram negatif. Sekali diwarnai dengan zat warna basa, warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan alkohol, meski dibubuhi dengan iodium. Basil tuberkel yang sebenarnya ditandai oleh sifat tahan asam misalnya 95 % etil alkohol yang mengandung 3 % asam hidroklorida (asam alkohol) dengan cepat akan menghilangkan warna semua bakteri kecuali Mycobakteria. Sifat tahan asam ini bergantung pada integritas struktur selubung berlilin. Pada dahak atau irisan jaringan, Mycobakteria dapat diperlihatkan karena memberi fluoresensi kuning jingga setelah diwarnai dengan zat warna fluorokrom (misalnya auramin, rodamin).

(c) here

(c) here

Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark, Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884.

Hans Christian Gram lulus kedokteran dari universitas Kopenhagen di Denmark pada tahun 1883. Dalam perjalanannya mengelilingi Eropa, Gram mempelajari farmakologi dan bakteriologi. Setahun kemudian, di Berlin (1884) ia menemukan metode pewarnaan bakteri yang kemudian dinamakan berdasarkan namanya. Dia mengikuti dan mengembangkan metode Paul Ehrlich, yaitu menggunakan aniline-air dan larutan gentian violet. 

Setelah pewarnaan lebih lanjut dengan larutan Lugol dan etanol ia menemukan bahwa beberapa bakteri tetap mempertahankan larutan gentian violet (Gram positif) sementara yang lain tidak (Gram negatif). Penemuan ini adalah penemuan besar dalam identifikasi dan klasifikasi bakteri. Hal ini juga berguna dalam menentukan pengobatan bagi penyakit-penyakit yang disebabkan bakteri. 



Zat warna yang biasa digunakan untuk mengecat bakteri adalah methylene blue, basic fuschin, dan crystal violet. Semua zat warna ini bekerja baik pada bakteri karena zat warna ini menghasilkan ion warna (chromophore) yang mempunyai muatan positif. Bakteri mempunyai muatan negatif karena itu menarik chromophore kationik. 


Zat warna terdiri dari zat warna basa seperti methylene blue (methylene chloride), serta zat warna asam yang mempunyai chromophore anionik contohnya eosin. Chromophore anionik, eosinate, tidak dapat dipakai untuk mengecat bakteri. Waktu pengecatan antara 30 detik-2 menit tergantung afinitas zat warnanya.

Cat Gram yang digunakan terdiri dari 4 macam, yaitu :

Larutan/cat gram A (Carbol Gentian Violet), sebagai cat utama 

Larutan/cat gram B (Lugol), untuk mengintensifkan warna 

Larutan/cat gram C (Alkohol 96%), peluntur/pencucian 

Larutan/cat gram D (Fuchsin),cat penutup/cat lawan 

Masing-masing zat warna memberikan warna yang berbeda-beda. Fuchsin memberikan warna merah keungu-unguan, Safranin memberikan warna merah, Carbol Gentian Violet memberikan warna ungu, methylene blue memberikan warna biru dan safranin memberikan warna merah. 

Komposisi dan fungsi masing-masing cat Gram, adalah sebagai berikut : 
1. Cat Gram A 
Cat ini terdiri atas : 
Kristal violet : 2 gram 
Etil alkohol 95 : 20 ml 
Ammonium oksalat : 0,8 gram 
Akuades : 80 ml 

Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet). Cat Gram A merupakan cat primer yang akan memberi warna mikroorganisme target. Pada saat diberi cat ini, semua mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A. 

2. Cat Gram B 
Cat ini terdiri atas : 
Yodium : 1 gram 
Kalium Yodida : 2 gram 
Akuades : 300 ml 

Cat Gram B berwarna coklat. Cat Gram B merupakan cat Mordan, yaitu cat atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme target. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat). 

3. Cat Gram C 
Cat ini terdiri atas : 
Aseton : 50 ml 
Etil alkohol 95 % : 50 ml 

Cat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya. Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan : 

Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian disebut bakteri Gram positif. 

Bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif. 

4. Cat Gram D 
Cat Gram D terdiri atas : 
Safranin : 0,25 gram 
Etil alkohol 95 % : 10 ml 
Akuades : 90 ml 

Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Akibat pemberian cat Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan : 

Bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu, karena telah jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu lagi mengikat cat Gram D. 

Bakteri Gram negatif akan berwarna merah, karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu mengikat cat Gram D. 

Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. 

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50nm) sedangkan pada bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).


(c) here

Skema Pengecatan Gram



Powered by Blogger.